Синтез гена

Гены: что это такое и как они работают. Что такое хромосомы?

Синтез гена

Ген – это наследственный фактор, в котором зашифрован определенный признак организма. Физически ген представляет собой участок ДНК (реже – РНК), который задает последовательность белков либо функциональной РНК. Совокупность генов в организме называют генотипом, а науку о генах – генетикой.

Всё началось с гороха

Аббат Грегор Мендель, австрийский ботаник и биолог, заметил, что потомство не всегда повторяет признаки, которыми обладали родители. Чтобы понять взаимосвязь, Мендель стал выращивать горох, скрещивать различные растения и отслеживать частоту наследования признаков.

Мендель доказал, что отдельные признаки (цвет, форма цветка и т.д.) могут наследоваться независимо. Он вывел теорию доминантных и рецессивных признаков, описал явление прерывистого наследования, математически интерпретировал результаты своих экспериментов.

Труды Менделя впервые опубликовали в 1866 году. Именно его считают основоположником генетики.

До этого ученые считали, что родительские признаки смешиваются подобно жидкости и потомки наследуют именно такой «коктейль». Теория пангенезиса, которую Чарльз Дарвин сформулировал в 1868 году, также следует этой концепции.

Впрочем, Дарвин считал, что «коктейль» состоит из мельчайших отдельных частиц – геммул. Они смешиваются во время зачатия. В целом ученый был недалек от истины.

Собственно термин «ген» в 1909 году ввел Вильгельм Йоханнсен. До этого признаки называли пангенами.

Днк как носитель генов

В 1940-е годы американский биолог Освальд Эвери из Рокфеллеровского института доказал, что дезоксирибонуклеиновая кислота, которая присутствует в ядре клетки, является физическим носителем генетической информации. В экспериментах с пневмококками он установил, что только ДНК, а не белок или другие компоненты, передает признаки от бактерий к их наследникам.

Первые фото ДНК удалось получить только в 1953 году Розалинд Франклин и Морису Уилкинсу. На их основе Джеймс Д. Уотсон и Фрэнсис Крик разработали модель молекулы двухцепочечной спирали ДНК, а также сформулировали теорию генетической репликации – создания двух дочерних ДНК от материнской клетки.

Всё это привело к появлению главной догмы молекулярной биологии. РНК (рибонуклеиновая кислота, одинарная цепочка) транскрибируется с ДНК: ДНК выступает в качестве базы, с которой на РНК переносится информация. При этом белки транслируются с РНК. Обратный процесс (когда ДНК создается по РНК) происходит только в некоторых вирусах, например, в ВИЧ (вирусе иммунодефицита человека).

ДНК состоит из четырех различных нуклеотидов: аденина (А), цитозина (Ц), гуанина (Г) и тимина (Т). Они образуют спаренные основания: ЦГ, АТ, ГЦ, ТА. Противоположные основания в спирали ДНК связаны водородными связями.

Что такое хромосомы

Хромосома образуется из очень длинной молекулы ДНК, которая содержит повторяющиеся цепочки генов. У каждого вида свой набор хромосом (кариотип). Например, у человека 46 хромосом: 22 пары аутосом разной длины и пара половых хромосом – XX или XY.

В геноме человека насчитывается 20-25 тыс. генов. Если молекулу ДНК из самой длинной хромосомы расположить вдоль линии, она займет около 1,5 м. Длина отдельного участка ДНК, который кодирует ген, составит всего 0,005 мм.

Место хранения определенного гена в хромосоме называют локусом. В каждом локусе – определенный аллель гена, одна из нескольких его форм.

Аллели могут быть одинаковыми – тогда говорят, что организм гомозиготный. Если аллели разные, то один из них главенствует, доминирует над другим. Доминантный ген подавляет рецессивный. В результате проявляется только один признак, но наследуются оба.

Набор хромосом и аллелей генов в них определяет наш внешний вид, физические и психические данные. Это база, которую затем изменяют природа, среда, образ жизни и т.д.

Как работают гены

Гены можно разделить на две группы – структурные и регуляторные. В структурных генах хранится информация о полипептидных цепях – это собственно признаки. Регуляторные, или функциональные гены включают и выключают структурные гены.

Назначение структурного гена в любом организме – в нужный момент обеспечить появление в клетке белка, который он кодирует. Чтобы это произошло, задействуются различные части гена.

Так, промотор, который находится перед белок-кодирующей частью, задает основные характеристики активности гена. Промотор определяет, в каких клетках будет работать ген, насколько долго и с какой интенсивностью. В конце гена находится терминатор – это сигнал конца цепочки.

РНК-полимераза проходит путь от промотора до терминатора и выполняет синтез матричной РНК – своеобразной инструкции для синтеза белка, правильного расположения в нем нужных аминокислот. Этот процесс называют транскрипцией.

Регуляторные гены – это гены-регуляторы и гены-операторы. Оператор непосредственно связан с определенной группой структурных генов (и такая конструкция называется «оперон»). Регулятор через белок-репрессор воздействует на структурные гены и обеспечивает синтез белка – трансляцию.

В синтезе белка участвует два десятка аминокислот. Каждые три нуклеотида ДНК кодируют определенную аминокислоту. Трансляция происходит на базе РНК-копии гена из ДНК:

  1. Матричная РНК выходит из ядра клетки в цитоплазму и связывается с рибосомой.

  2. В рибосоме синтезируется РНК-копия гена по инструкции из матричной РНК. Затем у этой РНК-копии будет синтезироваться белок.

  3. Из РНК-копии удаляются нитроны – нуклеотиды, которые не нужны для синтеза белка.

  4. Оперон начинает реакцию по синтезу белка. Пока молекул белка недостаточно, белок-репрессор неактивен.

  5. Как только накопилось достаточно молекул синтезируемого белка, белок-репрессор активируется.

  6. Он связывается с геном-оператором.

  7. После связывания синтез белка прекращается.

Что такое мутация

При репликации (копировании) ДНК очень редко, но всё же могут возникать ошибки. Их называют мутациями. Ученые подсчитали, что представитель каждого нового поколения несет в своем геноме 1-2 новых мутации.

Обычно мутации возникают из-за повреждения ДНК в процессе копирования. Они могут привести к хромосомным аномалиям: когда достаточно большие участки хромосомы дублируются, удаляются или перегруппируются.

В результате мутаций белки начинают синтезироваться неправильно. В целом в организмах есть механизмы «ремонта» ДНК после мутаций или уничтожения клеток-мутантов, но они не всегда срабатывают.

Если мутации происходят в половой клетке, у плода могут неправильно сформироваться целые органы и системы. Если в обычной клетке, то могут появиться доброкачественные или злокачественные образования.

С другой стороны, отдельные мутации оказывались удачными. Они сыграли важную роль в процессе естественного отбора и привели к созданию более выносливых и приспособленных организмов.

Источник: https://www.anews.com/p/123881962-geny-chto-ehto-takoe-i-kak-oni-rabotayut-chto-takoe-hromosomy/

50 лет назад в США был синтезирован первый искусственный ген. Как это повлияло на науку

Синтез гена

Полвека назад, 3 июня 1970 года, в США был синтезирован первый искусственный ген. Рассказываем, почему это важно.

Хар Гобинд Корана празднует присуждение Нобелевской премии 1968 года у доски и в окружении коллег. Tom RajBhandary

Пятьдесят лет назад, 3 июня 1970 года в газете New York Times появилась заметка, где говорилось, что команда из Висконсинского университета в Мадисоне сообщила о первом полном синтезе гена — «унаследованном кодированном „сообщении“, которое сообщает клетке, как выполнять определенную химическую функцию».

По словам авторов, уникальность в том, что ранее другие исследователи использовали «природный ген» для создания нового, тогда как в этом случае «гигантская молекула» была собрана с нуля, клетка за клеткой — все 77 нуклеотидов.

Для сравнения: генетический материал, содержащийся в клетке человека, содержит примерно шесть миллиардов таких единиц (или 3,2 пар нуклеотидов), хотя они не все функциональны.

Первый искусственный ген был создан благодаря доктору по имени Хар Гобинд Корана и его коллегам в университете в Мадисоне. Их достижение «знаменует новый шаг на пути к манипуляциям с наследственным материалом у растений, животных и, возможно, человека».

Это произошло всего через год после того, как профессора Гарвардского университета Джеймс Шапиро (James Shapiero) и Джонатан Беквит (Johnathan Bechwith) в принципе выделили первый ген.

Почему это важно

Как говорится в публикации Массачусетского технологического института, подъем «информационной эры» во второй половине XX века был вызван двумя факторами — научной и технологической революциями.

Вначале была цифровая революция, которая возникла с развитием математики, необходимой для вычисления и хранения данных, полностью основанной на двоичном коде. Вторая революция произошла благодаря открытию, что информация, закодированная в молекулярной последовательности ДНК, несет «инструкции» для рабочих частей клетки.

Область молекулярной биологии возникла как исследование того, как генетическая информация передается от одного поколения к другому. В результате это привело к методам чтения и записи биологической информации и изменению геномов согласно замыслу людей. Способность «перепрограммировать» живые организмы в нужных целях составляет основу биотехнологической индустрии.

Одним из тех, кто стоял у истоков, были учебные заведения США. Так, Массачусетский технологический институт еще в конце 1950-х начал набор молекулярных биологов — до того как эта зарождающаяся область исследований была признана официально.

Одним из таких сотрудников был Александр Рич, который пришел в Массачусетский в 1958 году — он внес вклад в понимание, как отдельные нити молекул ДНК и РНК могут находить и сочетать комплементарные последовательности. А вторым чрезвычайно влиятельным сотрудником стал Сальвадор Лурия, который был лидером в изучении бактериофагов — вирусов, которые заражают бактериальные клетки.

К 1960-м годам понимание фундаментальных генетических механизмов, разработанных Лурией и другими, соединилось с работой структурных биологов, таких как Рич, чтобы дать общее представление о том, как генетическая информация хранится, копируется и читается.

Это дало почву для исследований такого значимого ученого как Хар Гобинд Корана, уроженца Индии и сына деревенского налогового инспектора, который добился многого благодаря своему уму и трудоспособности.

До того как он переехал в Массачусетс в 1970 году, Корана успел поработать в Кембриджском университете в Великобритании и побыть директором отдела органической химии Исследовательского совета Британской Колумбии в Университете Британской Колумбии в Ванкувере (Канада).

Однако на пике своей карьеры Корана решил, что уже достиг всего, чего мог, и переехал в Висконсинский университет в Мадисоне, чтобы совершить на тот момент невозможное — первым синтезировать ген.

И ему это удалось — первый искусственный ген был химически синтезирован в 1970 году. Затем Корана синтезировал ген, родственный первому, и в 1979 году продемонстрировал, что они функционируют в бактерии. А в 1972 году ученый описал полный химический синтез функциональных генов тРНК, что стало беспрецедентным достижением в области химической биологии.

Для синтеза генов были использованы ферменты полимераза и лигаза, скрепляющие вместе фрагменты ДНК а также методы, предвосхитившие изобретение полимеразной цепной реакции. Безусловно, этого не удалось бы достичь, если бы Корана не обладал видением конечной цели и способностью убедить команду следовать за ним и пытаться сделать то, что до них не делал никто.

Эта работа стала поворотным пунктом в генетике — она положила начало эре рекомбинантной ДНК и лежит в основе методов сборки целых геномов из коротконитевых ДНК. Благодаря этому изобретению сегодня многие компании могут заказать себе любой синтетический ген.

Более того, Корана и его коллеги установили, что биологический язык, общий для всех живых организмов, состоит из набора трехбуквенных слов: каждый набор из трех нуклеотидов кодирует специфическую аминокислоту — за это они и получили Нобелевскую премию 1968 года.

Еще одним из ключевых технологических достижений, проистекающих из работы Кораны, стало развитие полимеразной цепной реакции — ПЦР, которая часто сейчас упоминается в связи с тестами на COVID-19. В этой реакции используются те же основные элементы, которые были предложены ученым еще в 60−70-х годах.

Таким образом, исследования Кораны стали важной частью информационной эры.

Недавно в Беларуси начались продажи Xiaomi Redmi Note 9S — нового потенциального хита производителя. Цена стартовой версии составляет 649 рублей. Разбираемся, в чем главные плюсы и минусы устройства и можно ли назвать его новым «народным героем».

«Какой же ты огромный!»

Первая реакция, когда берешь в руку новый Redmi Note 9S: какой же ты огромный! Для сравнения: по габаритам гигантский Galaxy Note10+ от Samsung не намного, но все же меньше Redmi Note 9S. Важно понимать: в кармане джинсов такой девайс не поносишь. Ситуация усугубляется, если надеть на аппарат защитный чехол (есть в комплекте поставки).

Я не против смартфонов с увеличенными дисплеями. Скорее наоборот: играть, смотреть фильмы, да и просто залипать в Instagram на таких устройствах гораздо удобнее. Но в Xiaomi Redmi Note 9S львиную часть пространства занимают толстые рамки сверху и снизу от экрана.

Если бы их сделали чуть меньше, то общие габариты наверняка получилось бы удержать в разумных пределах. В общем, перед покупкой повертите смартфон в магазине в руках и решите, удобно ли вам будет с ним управляться.

Несущая рама новинки — пластиковая, спереди и сзади — закаленное стекло Gorilla Glass 5. Есть 3,5-мм разъем для наушников, а вот NFC решили не встраивать.

Зато в активе ИК-порт для управления бытовой техникой и технология защиты от брызг. Но не стоит обманываться — плавать со смартфоном не стоит. Максимум, на что можно рассчитывать, так это на прогулку во время дождя.

А еще устройство позволяет установить одновременно две nanoSIM-карты и карту памяти microSD — удобно.

Пару слов о сканере отпечатков. Он совмещен с клавишей питания и находится на правой грани Redmi Note 9S. В предыдущем Redmi Note 8 Pro датчик находился на задней панели. Субъективно, эргономически принципиальной разницы нет — оба варианта хороши. Спасибо, что сканер решили не встраивать в экран: в бюджетных моделях такие датчики действуют медленно.

Впрочем, со скоростью разблокировки в новинке не все так радужно. Но проблема явно софтверная — надеюсь, ее поправят в обновлении прошивки. Палец владельца всегда распознается правильно, но экран после этого активируется примерно через секунду. Такая же история и с 2D-разблокировкой по лицу — когда двойным постукиванием по панели «будишь» смартфон, экран активируется не сразу.

Если вкратце: смартфон очень большой — перед покупкой повертите его в руках.

К плюсам относятся технология защиты от брызг, стеклянный корпус, сохранившийся 3,5-мм разъем для наушников, ИК-порт для управления бытовой техникой. Можно сразу установить две «симки» и карту памяти.

Минус один: «тупящий» сканер отпечатков пальцев — срабатывает не так быстро в сравнении с тем же Redmi Note 8 Pro. Но проблема наверняка программная, ее могут решить в обновлении прошивки.

Хороший экран и посредственный звук

Диагональ дисплея Redmi Note 9S — 6,67 дюйма. Разрешение — 2400 на 1080 точек (395 ppi), матрица — IPS, максимальная яркость экрана — 450 нит. Фронтальная камера на 16 Мп встроена в вырез в форме буквы «О» в центральной части панели. На мой взгляд, внешне это слегка роднит устройство со смартфонами от Samsung.

Глобально к экрану, с учетом стоимости аппарата, одна претензия — углы обзора. Если даже немного наклонить девайс, то изображение становится более тусклым.

Условно, посмотреть вдвоем кино станет проблематично — кто-то постоянно будет жаловаться на то, что картинка недостаточно яркая. Но все-таки плюсов у дисплея больше. Первый — его диагональ, потреблять контент удобно.

Цветопередача спокойная, оттенки передаются правильно.

А еще на дисплей «с завода» нанесена защитная пленка. Правда, на ней почему-то нет олеофобного покрытия. Это значит, что палец скользит хуже, чем обычно.

Если вкратце: дисплей хороший, наверняка понравится большинству потенциальных покупателей. Минус один — углы обзора, при наклоне смартфона картинка становится более тусклой. Также хотелось бы иметь возможность переключиться на 90 Гц вместо стандартных 60 Гц. Но пока это прерогатива более дорогих смартфонов.

И пару слов о качестве звука. Обычно мы подробно не останавливаемся на этом моменте, но в Redmi Note 9S творится что-то непонятное.

Если подключить к смартфону проводные наушники (например, стандартные EarPods от Apple), мелодии в них звучат примерно так же, как и на других устройствах.

Но при подсоединении беспроводной Bluetooth-гарнитуры (Samsung Galaxy Buds) громкость сильно падает. Все плагины Samsung и фирменное приложение я заранее установил.

Загадка с производительностью

Redmi Note 9S базируется на новом процессоре (SoC) Qualcomm — Snapdragon 720G (8-нм техпроцесс). На сайте Xiaomi уточняется, что он на 36% мощнее популярного Snapdragon 712. Оперативной памяти типа LPDDR4X — 4/6 ГБ, внутреннего хранилища (UFS 2.1) — 64/128 ГБ.

В AnTuTu (v8) результат смартфона — около 280 тысяч баллов. При этом Redmi Note 8 Pro на процессоре от MediaTek — Helio G90T — в этой же версии программы набирает немного больше. Прироста по производительности не ощущается. Но проблема не в этом.

По какой-то причине интерфейс Redmi Note 9S подтормаживает, причем ощутимо. Это становится особенно хорошо заметно, если открыть ленту новостей от Google на рабочем столе. Банальное перелистывание новостей как будто дается устройству с трудом. Отображение анимаций — например, вызова списка многозадачности при управлении жестами — также «запаздывает». И все это на последней версии прошивки.

При этом в программах, более требовательных к аппаратной составляющей смартфона — тех же играх, — проблемы отсутствуют. Call of Duty Mobile автоматически предлагает средние настройки графики, и, по ощущениям, после трех матчей fps не просел. В WOT Blitz проседаний также не было, аппарат держал стабильные 60 fps.

Ниже — результаты теста на троттлинг (падение производительности под нагрузкой). С этим у Redmi Note 9S все в порядке. С чем тогда связаны затруднения с работой интерфейса, непонятно. Остается надеяться, что ситуацию поправят в обновлении ПО.

Если вкратце: смартфону досталась новая аппаратная платформа, которая на данный момент все еще не до конца оптимизирована. Смартфон подтормаживает при работе с интерфейсом и при этом справляется с «тяжелыми» играми. Скорее всего, ситуация улучшится с обновлениями прошивки.

Время автономной работы — выше среднего

Redmi Note 9S оснащается батареей на 5020 мА·ч — это много. С учетом довольно энергоэффективного процессора на полной зарядке аппарат продержится день в смешанном режиме использования (постоянно включенный мобильный интернет, соцсети, , мессенджеры, музыка, почта, навигация, немного игр) и полтора-два дня — в чуть более щадящем. Хороший результат.

С зарядкой все чуть сложнее. Формально она быстрая — на 18 Вт (хотя в комплект к смартфону зачем-то кладут 22,5-ваттный блок питания). Но на восполнение энергии аккумулятора повышенного объема все равно затрачивается больше времени, чем хотелось бы. От 0 до 100% девайс заряжается более двух часов.

Если вкратце: из смартфона можно «выжать» до двух дней работы на одном заряде. Правда, на полную зарядку уходит немало времени.

Камера

Основная камера в смартфоне такая: 48 Мп (f/1.8) + 8 Мп (ультраширокоугольный модуль, f/2.2) + 5 Мп (макро, f/2.4) + 2 Мп (глубина, f/2.4).

Есть автоматический HDR и режим с использованием алгоритмов искусственного интеллекта. А еще устройство способно записывать 4K-видео (30 fps), правда, без стабилизации.

Кроме того, переключаться с камеры на камеру во время записи видео не получится.

Как и в большинстве других среднебюджетных аппаратов, третий и четвертый фотомодули (5 Мп и 2 Мп) гаджету не нужны — их внедрение в смартфон продиктовано маркетинговыми целями.

Кроме того, по умолчанию Redmi Note 9S снимает в разрешении 12 Мп, программно соединяя четыре пикселя в один увеличенного размера — технология уже не новая и хорошо себя зарекомендовавшая.

А еще есть 2-кратный зум — правда, программный. Он делается через кроп с главного фотомодуля.

Ниже — серия фотографий, сделанных на Redmi Note 9S при хорошем освещении. Первый снимок — на «ширик», второй — в обычном режиме. Все кадры созданы на полностью автоматических настройках:

А это — несколько фотографий с основного фотомодуля, но снятые уже вечером (обычный режим + «ночь»):

На мой взгляд, для смартфона из этой ценовой категории Redmi Note 9S снимает очень хорошо, но не намного лучше (или хуже) конкурентов. Есть и выделенный «ночной» режим, но кардинально ситуацию он не меняет. Впрочем, общая картина (особенно при работе с источниками света вроде фонарей) все же становится лучше.

Источник: https://42.tut.by/687123

Разработка генетических конструкций. Синтез генов

Синтез гена

Расчет последовательностей олигонуклеотидов проводим с использованием программы Gene2Oligo. Программа позволяет разбить последовательность гена, которую необходимо синтезировать, на небольшие уникальные олигонуклеотиды, с помощью которых удается получить четко заданную последовательность гена, минимизировав вероятность получения мутаций и других ошибок синтеза.

Для синтеза длинных генов целесообразно разбивать ген на фрагменты до 1 kb. Ввиду ошибок в процессе синтеза, вероятность получения правильной последовательности после сборки уменьшается при увеличении длины.

Разбивка последовательности гена на более короткие фрагменты увеличивает вероятность получения правильной последовательности и расчета более равномерной температуры плавления (Tm) для набора олигонуклеотидов, а также делает возможным параллельный синтез различных генов при одной температуре.

Имея универсальную Tm для всего множества олигонуклеотидов, можно осуществлять сборку с использованием лигазной цепной реакции (LCR) или полимеразной цепной реакции (ПЦР) при температуре ближе к средней Tm, не влияя отрицательно на гибриды с более низкой Tm. При более высокой температуре несоответствия имеют более сильный дестабилизирующий эффект, который уменьшает вероятность включения мутантных олигонуклеотидов в конечный продукт.

Однако важно использовать именно диапазон температур: при слишком узком диапазоне Tm, например, ± 1°C, нет практически никаких шансов получить набор олигонуклеотидов. Различие на 3-4°C является оптимальным.

Указывали имя последовательности и саму последовательность, ориентированную от 5 ‘-конца к 3’-концу. Выбирали между тремя режимами дизайна: в основе калькуляции – длина последовательности, с оптимизированным программой Tm, либо — Tm, если необходимо сосредоточить внимание на определенной температуре, третий режим просто позволяет разрезать последовательность.

Одновременная установка размера блока гибридизации, Tm в режиме приоритета длины требует особого внимания, чтобы избежать выбора взаимоисключающих значений. Например, нет возможности получения любых олигонуклеотидов, если выбранная температура слишком высокая или слишком низкая для данного размера олигонуклеотида (например, длина 15 nt и Tm 80°С не совместимы).

Устанавливали концентрацию ДНК и натрия в соответствии с условиями эксперимента, используемыми во время сборки. Изменение данных параметров влияет на вычисление Tm. Нет гарантии получения того же набора олигонуклеотидов при использовании различных концентраций ДНК или соли.

Расчет последовательностей олигонуклеотидов

Последовательность гена, и кодирующую цепь, и антисмысловую, разбивали на олигонуклеотиды с использованием программы Gene2Oligo. Олигонуклеотиды подбирали таким образом, чтобы их концы перекрывались олигонуклеотидом комплементарной цепи.

Все олигонуклеотиды имели схожие термодинамические свойства (температура плавления, Tm, различалась на 3°C) для обеспечения равномерной гибридизации в процессе сборки и были очень специфически подобраны, чтобы избежать неправильной сборки.

Длина каждого олигонуклеотида составила около 50-100 п.н. Олигонуклеотиды синтезировали с использованием твердофазного синтеза.

Синтез гена. Описание параметров

Поскольку размер олигонуклеотида динамичен и модифицируется в ходе проектирования, первый шаг заключался в добавлении короткой заглавной и следовой последовательности к исходной последовательности, что обеспечивало более высокую степень свободы при выборе олигонуклеотидов. Первый и последний олигонуклеотиды не обязательно должны были начинаться и заканчиваться на обоих концах исходной последовательности. Эти дополнительные последовательности удаляли в процессе окончательной ПЦР-амплификации путем тщательного подбора ПЦР-праймеров.

Конструировали олигонуклеотиды в пределах ± 4 nt по среднему размеру. S — средний размер, l – общая длина исходной последовательности, включая последовательность перед и после исходной.

Сначала вычисляли матрицу Tm для каждого положения исходной последовательности от 0 до l — (s — 4) и для гибридизационного блока длиной от s — 4 до s + 4.

Затем вычисляли среднее значение всех Tm — Tm ср — значение по умолчанию в отсутствие определяемых Tm.

Для каждой позиции в пределах от 0 до l — (s + 4), для прямой и обратной цепи исходной последовательности, генерировали набор из «подцепей» длины s + 4, который использовали для создания доменной базы данных. Всю исходную последовательность затем проанализировали против базы данных с использованием инструмента WU-Blast для поиска сходства последовательностей.

WU-BLAST построен следующим образом: E5000 V1 W5 W5 B100000 gapS2 = 1 S2 = 1 hspmax = 0 warnings matrix = GT.

Первые восемь опций установлены для представления любого выравнивания, охватывающего, по крайней мере, пять последовательных нуклеотидов, в то время как они не сообщают об описании одной цепи, что не имеет отношения к нашему случаю.

GT матрица позволяет заменять G на А и Т на С без дополнительного значения, уделенного стабильному спариванию GT в ДНК (Allawi et al., 1998) Результат Blast анализировали для выявления соответствия олигонуклеотидов более чем одному региону исходной последовательности.

Tm вычисляли для каждого предполагаемого олигонуклеотида перекрестной гибридизации любого размера, начиная от s – 4, s+ 4. Если Tm была выше порога, установленного на Tm Ср — 20, этот кандидат считали неспецифическим и сообщали об этом в матрице специфичности.

Затем строили матрицы длины путем разбора и Tm и матрицы специфичности. Для каждой позиции исходной последовательности от 0 до l — (s — 4) выбирали два олигонуклеотида, удовлетворяющих всем следующим условиям:

  • Минимальный | Tm — Tm Ср |,
  • Tm > Tm Ср — д Tm ,
  • Tm < Tm Ср + д Tm ,

где д Tm является диапазоном Tm, определенным пользователем (или выбранным одним из четырех по умолчанию). Если об этих кандидатах не было указано, что они исключены из матрицы специфичности, то их размеры помещали в матрицу длины. Если ни один олигонуклеотид не был найден в данном положении, то это положение помечали как негодное в матрице длине.

Окончательный выбор олигонуклеотидов состоял из анализа матрицы длины, которая может рассматриваться как дерево. Чтение начинается в положении, соответствующем первой нуклеотидной последовательности, введенной в интерфейсе, за исключением заглавной последовательности.

Длину первого олигонуклеотида считывали и использовали для указания начальной позиции следующего кандидата. Длина второго кандидата определяла начальное положение третьего кандидата, и так далее до конца исходной последовательности, пока она не был достигнута или до достижения негодного положения.

В последнем случае возвращались на один шаг назад и брали второй лучший размер олигонуклеотида и проверяли, приводит ли это к правильному решению. Если нет, делали еще один шаг назад, чтобы изучить новые ветви «дерева». Можно было вернуться на всем пути в исходное положение и так изучить все возможные ветви «дерева».

В худшем случае, когда не обнаруживали годный набор олигонуклеотидов, начинали процесс с первого основания заглавной последовательности (положения «-1» относительно начала исходной последовательности). Данную операцию повторяли до полного набора олигонуклеотидов или пока не доходили до конца заглавной последовательности.

В последнем случае не существует решения, удовлетворяющего критериям проектирования.

Выбор режима

В режиме приоритета длины можно выбрать средний размер для гибридизационного блока. По умолчанию программа использует Tm ср, рассчитанную для данного среднего размера и Tm ± 4°C для поиска набора олигонуклеотидов, удовлетворяющих всем условиям, описанным выше.

  • Режим приоритета температуры плавления.

В этом режиме устанавливают значение для Tm ср и Tm. Программа автоматически вычисляет средний размер блока гибридизации, который приведет к ближайшим Tm к исходной Tm. После этого производят вычисления, описанные выше. Этот режим можно рассматривать как режим приоритета времени с использованием оптимального среднего размера для этой Tm.

Возможна обрезка последовательности в олигонуклеотиды равной длины. Нет оптимизации в режиме, позволяющем избежать неспецифической гибридизации между различными олигонуклеотидами или обеспечить хорошую однородность Tm. Заглавную последовательность не добавляют, используют только короткую концевую последовательность, чтобы получить правильный размер последнего олигонуклеотида.

Для синтеза гена интереса выбрали режим приоритета длины.

Выбор методик синтеза гена

  • ПЦР-сборка (Assembly PCR).

ПЦР-сборку проводят в объеме 50 мкл, содержащем 200 мкМ каждого дНТФ, 0,1 мкМ каждого олигонуклеотида, 0,5 ед Taq ДНК-полимеразы или 1 ед Pfu ДНК полимеразы в буфере, содержащем 2,5 мМ MgCl2.

Осуществляют ПЦР-сборку: денатурируют при 95°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами при 95°С в течение 30 сек, 52°С в течение 30 сек и при 72°С в течение 1 мин, заканчивают инкубацию при 72°C течение 5 мин.

  • Лигазная цепная реакция (LCR).

LCR проводят в конечном объеме 25 мкл, содержащем 0,1 мкМ каждого олигонуклеотидного фосфорилировали с использованием полинуклеотидкиназы Т4 и 10 единиц Taq ДНК-лигазы. LCR проводят следующим образом: 94°С в течение 2 мин, 40 циклов при 94°С в течение 30 сек, 51°С в течение 4 мин.

Полноразмерный продукт после LCR или сборки реакции ПЦР подвергают ПЦР-амплификации с использованием праймеров в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 3 мкл смеси ПЦР-сборки или 5 мкл смеси LCR, 200 мкМ каждого дНТФ, 1 мкМ каждого праймера, 0,5 ед Taq ДНК-полимеразы или 1 ед Pfu ДНК полимеразы и буфер, содержащий 2,5 мМ MgCl2. ПЦР: денатурация при 95°С в течение 2 мин с последующими 30 циклами при 95°С в течение 30 сек, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин, завершающая инкубация при 72°С в течение 5 мин.

После чего гены клонируют по сайту EcoRV в векторе pUC57 и проводят секвенирование вставки. При наличии небольших мутаций проводят их сайт-специфический мутагенез.

Источник: http://innovaplus.ru/services/razrabotka-geneticheskix-konstrukcij-sintez-genov/

Доктор-про
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: